Lasermikroskopie

Der Laser dient als Lichtquelle mit mehreren Linien zur Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe. Der Scanner enthält die konfokale Pinhole-Anordnung und einen Strahlteiler, der das Anregungslicht reflektiert und das zu detektierende Fluoreszenzlicht durchläßt. Das Anregungslicht wird durch einen beweglichen Spiegel rasterförmig über das unter dem Mikroskop befindliche Objekt bewegt. Ein Detektor weist das vom Objekt reflektierte oder emittierte Fluoreszenzlicht nach Farben selektiert nach. Das gesamte System wird von einem Rechner gesteuert.

Informationen, die nicht aus der Bildebene des Mikroskops stammen, werden vor dem Detektor ausgeblendet. Hierdurch erhält das konfokale Mikroskop seine einzigartige Eigenschaft "optische Schnitte" durch die Probe zu legen.

Die Auswertung von Fluoreszenzsignalen bedeutet für die Lichtmikroskopie eine beträchtliche Erweiterung der Differenzierungsmöglichkeiten. Viele Zellen oder Zellbestandteile verfügen über eine eigene auswertbare Fluoreszenz, die für Nachweisverfahren eingesetzt wird. Unter Umständen stören diese "Autofluoreszenzen" und erschweren die Analyse in bestimmten Fluoreszenzbereichen. Erst die Anwendung von Fluoreszenzfarbstoffen – z.B. zusammen mit spezifischen Antikörpern, erlauben exakte Markierungen, die - nach entsprechender Bildaufbereitung - präzise Lokalisierungen von Zellbestandteilen ermöglichen. Eine Vielzahl von Farbstoffen (Fluorophoren) steht zur Verfügung, die mit Laserlinien im UV und sichtbaren Bereich angeregt werden können. Einfach- und Mehrfachmarkierungen lassen außerdem die Bestimmung von lonenkonzentrationen zu. Enzymaktivitäten werden durch die Umwandlung von nichtfluoreszierenden Komplexen zum Fluoreszenzfarbstoff bestimmt. Als revolutionären neuer Farbstoff hat sich GFP (grün fluoreszierendes Protein) erwiesen, ein fluoreszierendes Protein aus der pazifischen Qualle Aequorea victoria, das in Varianten mit unterschiedlichen Emissionsmaxima gebildet werden kann. Dieses Instrumentarium schafft für die biomedizinische Forschung, Molekulargenetik und auch die Biotechnologie die Möglichkeit, Entwicklungsschritte, Reaktionen auf Umgebungseinflüsse, Signalübertragungen und Stoffwechselwege aufzuklären. Durch zeitversetzte Aufnahmen werden dynamische Vorgänge (die so genannte 4D-Darstellung) aufgezeigt. Zeitlicher und räumlicher Verlauf der Wiederzunahme der Fluoreszenz nach Ausbleichvorgängen (Fluorescence Recovery after Photobleaching; FRAP) geben Auskunft über Diffusionsvorgänge und damit über Dynamik molekularer Bewegungen und die chemischen Veränderungen der fluoreszenzgekoppelten Moleküle

Mit der Koppelung eines klonierten GFP-Gens an zu untersuchende Gensequenzen entsteht bei der Proteinausbildung ein - durch Fluoreszenz - nachweisbarer Komplex. Sowohl durch die Erhöhung der Detektionswirksamkeit des "clsm" als auch durch die Entwicklung neuer Fluoreszenzfarbstoffe und –färbemethoden erweitert sich das Methodenspektrum und damit die Anwendungsbereiche.